page_banner

Новини

Методи та застосування принципу кількісної ПЛР флуоресценції в реальному часі

Кількісна флуоресцентна ПЛР у режимі реального часу — це метод вимірювання загальної кількості продукту після кожного циклу полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) у реакції ампліфікації ДНК за допомогою флуорофора.Цей метод використовується для кількісного визначення конкретних послідовностей ДНК у зразку, що підлягає тестуванню за допомогою внутрішніх або зовнішніх еталонних методів.З моменту свого створення флуоресцентні кількісні ПЛР-тести набувають все більшої популярності серед викладачів-лаборантів.

Принцип флуоресцентної ПЛР: флуоресцентна ПЛР, спочатку названа TaqManPCR, а пізніше також Real-TimePCR, є новою технікою кількісного визначення нуклеїнових кислот, розробленою PE (PerkinElmer) у США в 1995 році. Методика базується на додаванні флуоресцентно міченого зонда або відповідного флуоресцентного барвника до звичайної ПЛР для досягнення його кількісної функції.Принцип: у міру протікання ПЛР-реакції продукти ПЛР-реакції накопичуються, а інтенсивність флуоресцентного сигналу зростає рівномірно.З кожним циклом збирається сигнал інтенсивності флуоресценції, щоб ми могли контролювати зміну кількості продукту за зміною інтенсивності флуоресценції та таким чином отримати графік кривої ампліфікації флуоресценції.

Флуоресценція в реальному часі3
Флуоресценція в реальному часі2

Загалом, криву ампліфікації флуоресценції можна розділити на три фази: фазу фонового сигналу флуоресценції, фазу експоненціального посилення сигналу флуоресценції та фазу плато.Під час фази фонового сигналу посилений сигнал флуоресценції маскується фоновим сигналом флуоресценції, і зміни в кількості продукту визначити неможливо.У фазі плато продукт ампліфікації більше не зростає експоненціально, немає лінійного зв’язку між кількістю кінцевого продукту та початковою кількістю матриці, а початкову кількість копій ДНК не можна розрахувати на основі кінцевої кількості продукту ПЛР.Лише у фазі експоненційної ампліфікації флуоресцентного сигналу існує лінійна залежність між логарифмом кількості продукту ПЛР та початковою кількістю матриці, і ми можемо вибрати кількісну оцінку на цьому етапі.Для зручності кількісного визначення та порівняння в методику флуоресцентної кількісної ПЛР у реальному часі введено два дуже важливі поняття: поріг флуоресценції та значення КТ.

Поріг — це штучно встановлене значення на кривій посилення флуоресценції.експоненціальна фаза ПЛР-ампліфікації.

Значення Ct: це кількість циклів, які пройшов сигнал флуоресценції в кожній реакційній пробірці, щоб досягти заданого значення домену.

Зв’язок між значенням Ct і початковим шаблоном: дослідження показали, що значення Ct кожного шаблону має лінійну залежність від логарифма початкової кількості копій цього шаблону. Що більше копій початкової кількості копій, то менший Ct значення.Значення Ct є відносно стабільними.Стандартну криву можна створити за допомогою стандарту з відомим початковим номером копії, де горизонтальна координата представляє логарифм початкового номера копії, а вертикальна координата представляє значення Ct, як показано на малюнку нижче.

Тому, отримавши значення Ct невідомого зразка, початкову кількість копій цього зразка можна обчислити за стандартною кривою.

Значення Ct не є постійним і на нього можуть впливати різні зразки та різні прилади, навіть якщо той самий зразок повторюється 2 рази на одному приладі, значення Ct може змінюватися.

Кількісні аналізи флуоресценції: кількісні аналізи флуоресценції можна розділити на флуоресцентні зонди та флуоресцентні барвники залежно від використовуваних маркерів.Флуоресцентні зонди включають технологію Beacon (технологія молекулярного маяка, представлена ​​American Tagyi), зонди TaqMan (представлена ​​ABI) і технологію FRET (представлена ​​Roche);флуоресцентні барвники включають насичені флуоресцентні барвники та ненасичені флуоресцентні барвники, типовим представником ненасичених флуоресцентних барвників є SYBRGreen I, який зазвичай використовується зараз;насичені Типовим представником ненасичених флуоресцентних барвників є SYBRGreenⅠ;насичені флуоресцентні барвники EvaGreen, LCGreen та ін.

SYBRGreenI — це широко використовуваний ДНК-зв’язуючий барвник для флуоресцентної ПЛР, який неспецифічно зв’язується з дволанцюговою ДНК.У вільному стані SYBRGreenI випромінює слабку флуоресценцію, але після зв’язування з дволанцюговою ДНК його флуоресценція збільшується в 1000 разів.Таким чином, загальний сигнал флуоресценції, випромінюваний реакцією, пропорційний кількості наявної дволанцюгової ДНК і зростає зі збільшенням продукту ампліфікації.

Переваги дволанцюгових ДНК-зв’язуючих барвників: простий дизайн експерименту, потрібні лише 2 праймери, відсутність потреби у створенні зондів, відсутність потреби у створенні кількох зондів для швидкого тестування кількох генів, можливість виконання аналізу кривої точки плавлення, тестування специфічності реакція посилення, низька початкова вартість, хороша загальність і тому частіше використовуються в дослідженнях в країні та за кордоном.

Метод флуоресцентного зонда (метод Такмана): під час ПЛР-ампліфікації додається пара праймерів разом зі специфічним флуоресцентним зондом.Коли зонд неушкоджений, сигнал флуоресценції, випромінюваний репортерною групою, поглинається погашеною групою і не виявляється приладом ПЛР;під час ПЛР-ампліфікації (у фазі подовження) активність 5'-3' розщеплення ферменту Taq ферментативно деградує зонд, створюючи групу репортерної флуоресценції та групу погашеної флуоресценції

Застосування флуоресцентної кількісної ПЛР.

Дослідження молекулярної біології:

1. Кількісний аналіз нуклеїнових кислот.Кількісний та якісний аналіз інфекційних захворювань, виявлення патогенних мікроорганізмів або вірусів, таких як нещодавня епідемія грипу А (H1N1), виявлення кількості копій генів трансгенних рослин і тварин, виявлення рівня інактивації генів RNAi тощо.

2. Диференціальний аналіз експресії генів.Порівняння відмінностей експресії генів між обробленими зразками (наприклад, медикаментозна обробка, фізична обробка, хімічна обробка тощо), відмінностей експресії конкретних генів у різних фазах і підтвердження результатів мікрочипу кДНК або диференціальної експресії

3. Виявлення SNP.Виявлення однонуклеотидних поліморфізмів є важливим для вивчення індивідуальної сприйнятливості до різних захворювань або індивідуальної реакції на конкретні ліки, а завдяки геніальній структурі молекулярних маяків, коли інформація про послідовність SNP відома, легко і точно визначити використовуйте цю техніку для високопродуктивного виявлення SNP.

4. Виявлення метилювання.Метилювання пов’язане з багатьма захворюваннями людини, особливо раком, і Лейрд повідомив про техніку під назвою Methyllight, яка обробляє ДНК перед ампліфікацією таким чином, щоб неметильований цитозин перетворювався на урацил, а метильований цитозин залишався незмінним, використовуючи спеціальні праймери та зонди Taqman для розрізнення метильованої та неметильованої ДНК. .більш чутливий.

Медичне дослідження:

1. Пренатальна діагностика: люди не можуть лікувати спадкові захворювання, спричинені зміненим генетичним матеріалом, і поки що вони можуть лише зменшити кількість хворих дітей, народжених за допомогою пренатального моніторингу, щоб запобігти виникненню різноманітних спадкових захворювань.Це неінвазивний метод, який легко сприймають вагітні жінки.

2. Виявлення патогенів: флуоресцентний кількісний ПЛР-аналіз дозволяє кількісно визначити патогени, такі як гонокок, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma solium, вірус папіломи людини, вірус простого герпесу, вірус імунодефіциту людини, вірус гепатиту, вірус грипу, Mycobacterium tuberculosis, EBV і цитомегаловірус.Він має такі переваги, як висока чутливість, малий розмір вибірки, швидкість і простота порівняно з традиційними методами тестування.

3. Оцінка ефективності препарату: кількісний аналіз вірусу гепатиту B (HBV) і вірусу гепатиту C (HCV) показує зв'язок між вірусним навантаженням і ефективністю певних препаратів.Якщо рівень ДНК HBV у сироватці крові знижується під час лікування ламівудином, а потім знову підвищується або перевищує попередній рівень, це свідчить про мутацію вірусу.

4. Онкогенетичне тестування: хоча механізм розвитку пухлини ще не ясний, широко визнано, що мутації у відповідних генах є основною причиною онкогенної трансформації.Підвищену експресію та мутацію онкогенів можна спостерігати на ранніх стадіях багатьох пухлин.Кількісна флуоресцентна ПЛР у режимі реального часу ефективна не тільки для виявлення мутацій у генах, але також може точно виявляти експресію онкогенів.Цей метод використовувався для виявлення експресії різноманітних генів, включаючи ген теломерази hTERT, ген WT1 хронічного гранулоцитарного лейкозу, онкогенний ген ER, ген PSM раку передміхурової залози та гени, пов’язані з пухлиною.

Перекладено за допомогою www.DeepL.com/Translator (безкоштовна версія)


Час публікації: 21 червня 2022 р